Né à Tsingtao en Chine, Toshiro Mifune passe sa jeunesse dans la ville de Dalian, et travaille dans le magasin de photographie de son père. Bien qu'il soit né en Chine et parle couramment le mandarin, c'est en tant que japonais qu'il est enrôlé pendant la seconde guerre mondiale, où il travaille comme photographe aérien. Une fois la capitulation annoncée, il rentre au Japon, en 1946.
Il est embauché grâce à un ami à la Toho, en 1947, comme opérateur de prises de vue. Lors d'un concours organisé par la société, il fait forte impression auprès du réalisateur Kajiro Yamamoto qui lui obtient son premier rôle dans Shin Baka Jidai de Sankichi Taniguchi. Il est alors repéré par le jeune Akira Kurosawa, qui lui offre un rôle dans L'Ange Ivre, début d'une longue et fructueuse collaboration.
Son style très physique, intuitif et sa palette de jeu extrêmement large sont exploités au maximum par Kurosawa, avec lequel il tourne 16 films, dessinant une figure moderne du samourai rustre et violent, là où les chambaras classiques préféraient héroïser la figure du combattant. De cette collaboration sont nés bon nombre de chefs-d'oeuvre, parmi lesquels : Chien Enragé (1949), Rashomon (1950), Les 7 Samourais (1954), Le Garde du corps (1961) ou Entre le Ciel et l'Enfer.
Leur rupture après le tournage de Barberousse n'altère en rien la carrière de Mifune qui tourne avec les plus grands cinéastes japonais (Mizoguchi, Okamoto) et démarre une carrière internationale à la fin des années 60. Les films de Kurosawa ayant traversé les frontières, bon nombre de cinéastes occidentaux comme Terence Young avec qui il tourne Soleil Rouge (1971) ou John Boorman pour Duel dans le Pacifique (1968) font appel à ses services.
Sa participation à la série caricaturale Shogun dans les années 80 ternira quelque peu l'étoile de celui que les spectateurs surnomment "le plus japonais de tous les hommes". En 1993, après 20 ans de brouille, il se réconcilie avec Kurosawa. Deux ans plus tard, il succombe des suites d'un cancer du pancréas, le 24 décembre.
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