Stéphane Freiss a suivi la formation du Conservatoire National Supérieur d'Art Dramatique puis est entré à la Comédie Française en 1986. Il fait ses débuts à la télévision et apparaît pour la 1ère fois au cinéma dans le film Premiers désirs où il donne la réplique à Emmanuelle Béart. Il fait des apparitions dans les films Sans toit ni loi et Le Complexe du Kangourou.
En 1988 il joue dans Chouans ! film historique réalisé par Philippe de Broca aux côtés de Sophie Marceau et Lambert Wilson, et pour lequel il reçoit le César du meilleur espoir masculin. Dans le même genre, il joue dans La putain du roi, avec Timolthy Dalton, Monsieur N. réalisé par Antoine de Caunes, puis dans Entre deux mondes. Il joue aux côtés de Béatrice Dalle dans Les Bois Noirs de Jacques Deray puis dans le film Comme des rois. Il tient également le rôle d'Aladin dans Les 1001 Nuits avec Thierry Lhermitte.
En 2004, il tient le rôle principal dans 5 x 2 de François Ozon aux côtés de Valeria Bruni-Tedeschi. La même année, il joue dans Le Grand rôle de Steve Suissa, qui le révèle au grand public. On l'a également vu dans Betty Fisher et autres histoires et dans le film de Jean-Pierre Améris, Je m'appelle Elisabeth.
En 2008, il joue dans Ca se soigne de laurent Chouchan avec Thierry Lhermitte, donne la réplique à Anne Brochet pour Un Château en Espagne et fait partie de la distribution de l'un des plus gros succès français de tous les temps, le Bienvenu chez les Chti's de Danny Boon. En 2009, il prête sa voix au film d'animation Monstres contre Aliens.
