Sa passion pour le théâtre le pousse à interrompre ses études pour faire carrière sur scène. Castellito obtient ses premiers rôles au cinéma à partir de 1982, notamment dans Le général de l'armée morte de Luciano Tovoli. C'est à partir de 1986 que le grand public le découvre à travers les débuts de 3 jeunes réalisateurs, Marco Colli avec Giovanni senza pensieri, Claudio Sestieri avec Dolce Assenza et Felicia Farina avec Il semble mort.... seulement évanoui.
Castellito devient l'un des acteurs favoris du public italien avec son personnage du juge de la série télévisée Cane Sciolto de 1989 à 1991. Il connaît parallèlement le succès au cinéma, tournant avec des cinéastes italiens comme Giancaldo Soldi, Amanzio Todini, Ricky Tognazzi, Vittorio Sindoni, Carlo Verdone, Francesco Calogero. Il passe derrière la caméra en 1998 pour réaliser Libero Burro, dont il est aussi le scénariste et l'interprète aux côtés de Margaret Mazzantini, Chiara Mastroianni et Michel Piccoli. Ettore Scola le dirige dans La famille, Mario Monicelli dans Rossini ! Rossini !, Marco Ferreri dans La chair, Francesca Archibugi dans La grosse citrouille.
Il joue dans plusieurs films français dont Le grand bleu de Luc Besson, Le cri de la soie d'Yvon Marciano, Portraits chinois de Martine Dugowson, Que la lumière soit et Alberto Express d'Arthur Joffé, A vendre de Laetitia Masson ou encore Va savoir de Jacques Rivette. Sergio Castellitto joue également dans Concurrence déloyale d'Ettore Scola, Ora di religione de Marco Bellochio, Juste un baiser de Gabrielle Muccino, Ne quittez pas ! d'Arthur Joffé. En 2004, L'acteur signe sa première réalisation, A corps perdus, dans laquelle il a pour partenaire Penelope Cruz.
Côté théâtre, il s'est produit dans des pièces comme Mesure pour mesure sous la direction de Luigi Squarzina, Le marchand de Venise mise en scène par Memè Perlini, Trois sœurs et Mademoiselle Julie sous la direction d'Otomar Krejika, Pieds nus dans le parc de Neil Simon, mise en scène par Enrico Coltorti. Egalement metteur en scène, il a dirigé Margaret Mazzantini et Nancy Brilli dans Manola et a mis en scène et interprété le monologue Zorro écrit par Margaret Mazzantini. Par la suite, il est au casting de Paris, je t'aime ou encore prêtant sa voix dans Arthur et les Minmoys. En 2008, il est membre du jury du 61ème festival de Cannes, et se retrouve crédité à l'affiche du 2ème épisode des Chroniques de Narnia.
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