Mathieu Demy est né le 15 octobre 1972 à Paris, il est le fils de la réalisatrice et photographe Agnès Varda et du réalisateur et acteur Jacques Demy.
Cet enfant de la balle apparaît dès son plus jeune âge dans les films de son père, Trois places pour le 26 (1988)) et de sa mère Agnès Varda : L'Une chante, l'autre pas (1976), Mur, murs (1980), Documenteurs (1981) et Kung-Fu Master (1987) dans lequel il a pour maman Jane Birkin. En 1993, il apparaît dans A la belle étoile avec Melvil Poupaud, qu'il retrouve en 2000 dans Combat d'amour en songe (2000), La Chambre obscure (2000) et Pronobis.
En 1997, il tient le rôle principal, un jeune homme séropositif, dans la comédie musicale Jeanne et le garçon formidable réalisé par Olivier Ducastel et avec Virginie Ledoyen. Il joue ensuite dans la comédie Quand on sera grand (2000) dans Dieu est grand, je suis toute petite (2001) avec Audrey Tautou, puis dans Le Nouveau Jean-Claude (2002). En 2001, il rencontre le cinéaste Michaël Cohen qui le choisit pour jouer dans ses films : Acteurs anonymes puis Nos enfants chéris (2002) et Qui m'aime me suive en 2005.
On le voit également dans le policier Les Marchands de sable de Pierre Salvadori (2000), aux côtés de Simon Abkarian dans le drame Aram (2002), Mister V. (2002), Le Silence d'Orso Miret (2004) et dans le thriller Ecoute le temps avec Emilie Dequenne en 2005. En 2008, il est à l'affiche du Grand alibi de Pascal Bonitzer.
Mathieu Demy passe également derrière la caméra puisqu'il écrit et réalise 2 courts métrages En 2000, il signe le court Le Plafond, adapté d'une nouvelle de Tonino Benacquista. Cinq ans après, il réalise la comédie dramatique La Bourde, dans lequel il tient également le rôle principal. En 2009 on le retrouve à l'affiche du film La fille du RER de André Téchiné, inspiré d'un fait divers.
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