Jonathan Zaccaï est né en 1970 à Bruxelles. Il est le fils de la peintre Sarah Kalisky et le neveu du dramaturge René Kalisky. Le jeune homme envisage d'abord une carrière de réalisateur avant de se tourner vers le métier d'acteur. Après un passage par la publicité, il figure dans de nombreux spots et fait quelques apparitions au cinéma (La Révolte des enfants, 1991) et à la télévision (Lifeline, 1996).
En 2000, il campe le petit ami insatisfait de Corinne Debonnière dans Petite chérie (2000) d'Anne Villaceque, rôle qui lance sa carrière d'acteur. Par la suite, il joue dans Le tango des Rahveski de Sam Garbarski en 2003. En 2004, on le voit dans Le plus beau jour de ma vie, Les parallèles de Julie Lipinski, Le rôle de sa vie et les revenants. La même année, le grand public le découvre véritablement aux côtés d'Agnès Jaoui et Karin Viard dans Le Rôle de sa vie.
En 2005, il joue avec Romain Duris dans De battre mon coeur s'est arrêté, de Jacques Audiard et Entre ses mains d'Anne Fontaine. Il joue également en 2006 dans Toi et moi de Julie Lopes Curval. En 2007, on le retrouve dans Vent mauvais, les yeux bandés de Thomas Lilti et la chambre des morts.
Jonathan Zaccai a également réalisé 2 Courts-métrages : Sketches chez les Weisz en 2004 et Comme James en 2006.
En 2008, on le retrouve à l'affiche du controversé Elève libre de Joachim Lafosse et en 2009, il tient le rôle principal dans Simon Konianski de Micha Wald.
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