Né à Hamilton, au Canada, Eugene Levy obtient son diplôme à la Westdale High Schoolet fait ses débuts au cinéma grâce à Ivan Reitman qui l'intègre au casting de Foxy lady (1971) et Cannibal Girls (1973). Sa carrière est vraiment lancée grâce à sa participation à la série comique "SCTV" qu'il interprète et co-écrit de 1976 à 1982.
Fort de ce succès auprès du public américain, il se voit proposé quelques rôles intéressants au cinéma dans Splash, Bonjour les vacances (1983), Armés et Dangereux (1986), Le père de la mariée (1991) ou Mes Doubles, ma femme et moi où il retrouve un des cinéastes avec lequel il a le plus souvent collaboré, Harold Ramis. Durant les années 80, il participe également au show TV de stars comiques comme Martin Short ou Billy Crystal.
C'est en 1999 qu'il obtient un rôle qui lui colle désormais à la peau : il est le père de Jim Levenstein dans American Pie et (petit exploit) collabore aux cinq sequels du film, au cinéma et à la télévision. Depuis, il apparaît régulièrement dans des seconds rôles comiques, exploitant son talent de faire-valoir, notamment aux côtés de Steve Martin dans Le Père de la mariée 2 (1995), Bronx Bel-Air (2003) ou Treize à la douzaine 2 (2006).
Depuis 2006, Eugene Levy diversifie ses activités et se consacre notamment au doublage de dessins-animés. Il a été la voix (en version originale) de Lou dans Nos voisins les hommes et prête ses cordes vocales à Orrin dans Astro Boy en 2009. La même année, il est l'affiche du film Hôtel Woodstock d'Ang Lee.
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