Elle naît dans le sérail puisque ses parents sont tous 2 comédiens, et est donc dès son enfance immergée dans ce milieu et habituée à assister à de nombreuses répétitions théâtrales qui affinent sa vocation. Après quelques fugaces apparitions et participations à des courts-métrages, elle obtient son 1er grand rôle en 1991 dans La vie des morts d'Arnaud Despleshin, oeuvre déroutante de moins d'une heure, unanimement saluée par la critique et qui participe au festival de Cannes.
Dès lors elle devient une collaboratrice assidue du jeune cinéma d'auteur, et particulièrement de Despleshin dont elle accompagne toute l'oeuvre.
Elle travaille également avec d'autres figures emblématiques du créneau art et essai, notamment avec Noémie Lvovsky avec Oubli moi et La vie ne me fait pas peur, mais également Eric Rochant pour Les patriotes et Anna Oz.
D'une manière assez singulière, la carrière d'Emmanuelle Devos se distingue par un bel esprit de fidélité, puisqu'elle tourne à plusieurs reprises avec les mêmes cinéastes. Sa 3ème collaboration avec Despleshin pour Comment je me suis disputée ! (ma vie sexuelle) en 1996, lui vaut par ailleurs une nomination pour le César du meilleur espoir féminin. L'actrice continue de tourner régulièrement, mais malgré l'enthousiasme des journalistes à son égard et les nombreux articles dithyrambiques qui saluent ses diverses prestations, elle reste pour le public un visage anonyme.
En 1997, dans le but de diversifier son registre, elle tente une incursion dans la veine comique avec Le déménagement d'Olivier Doran, où elle donne la réplique à Danny Boon et Dieudonné, mais le film ne marche pas. On la voit également dans Peut-être de Cédric Klapish, aux côtés de Jean-Paul Belmondo et Romain Duris.
Elle travaille aussi de manière régulière à la télévision, sous la direction de Tonie Marshall, Serge Moati ou encore Patricia Mazuy. En haut de l'affiche avec Sur ses lèvres, 3ème réalisation de Jacques Audiard, elle forme avec Vincent Cassel un couple atypique d'anti-héros. La qualité de son interprétation d'une jeune femme malentendante, lui vaut encore une fois les louanges de la critique, et amène l'actrice à la reconnaissance publique.
En plus de sa présence sur les écrans, elle se distingue sur les planches, dans une pièce écrite par la mère de la réalisatrice Coline Serreau. En juin 2004, elle est à l'affiche de Bienvenue en Suisse de Lea Frazer. Cette même année, elle est de nouveau sur grand écran dans le film de Frédéric Fonteyne, La femme de Gilles.
Elle fait partie du casting de la comédie de Emmanuel Carrère, La moustache aux côtés de Vincent Lindon en 2005 avant de devenir l'héroïne du film de Sophie Fillières, Gentille. Elle retrouve Lindon en 2007 pour Ceux qui restent de Anne Le Ny puis Gérard Darmon pour Deux vies plus une. En 2008, elle est à l'affiche du film d'Arnaud Desplechin, Un conte de Noël, sélectionné au festival de Cannes. Elle tourne ensuite pour Xavier Giannoli, dont le film A l’origine lui vaut un César du Meilleur Second Rôle en 2010.
En 2012, elle est membre du Jury au 65ème festival de Cannes. Restée attachée au théâtre, elle poursuit la même année sa carrière sur le grand écran qui la fera tourner prochainement avec Martin Provost et avec Jérôme Bonnell aux côtés de Gabriel Byrne.
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