Il grandit en Pennsylvanie et fait ses études à l'University of California de San Diego. Il se produit à New York au Lafayette Theatre Drama Festival puis étudie à l'Ecole de théâtre du Circle in the Square. Il obtient une bourse pour suivre les cours du Stella Adler Conservatory. Benicio s'installe ensuite à Los Angeles et étudie à l'Actor's Circle Theater avant de jouer dans ses premières séries télévisées, dont Deux flics à Miami.
Il apparaît pour la 1ère fois au cinéma dans Permis de tuer où il est opposé à James Bond. Sa "gueule" de méchant le destine à une filmographie tournée vers les films d'action et les rôles de bad boys : Usual suspects, Snatch, Traqué...
En 2001, sa prestation dans Traffic de Steven Soderbergh lui apporte la consécration avec l'Oscar du meilleur acteur dans un second rôle. Ses choix le porte ensuite vers 21 grammes (2004), Sin City (2005) et Nos souvenirs brûlés (2007) aux côtés de Halle Berry. En 2007, il retrouve Soderbergh pour deux films sur la vie de Guevara : L'Argentin et Guerilla (qui sortent respectivement les 7 et 21 janvier 2009).
En 2010, il prend l'apparence du méchant loup-garou dans le film de Joe Johnston, et donne la réplique à Emily Blunt, Anthony Hopkins et Hugo Weaving.
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